rizkiak08's blog

Pendahuluan

Fraksi subseluler pada umumnya hanya digunakan untuk memisahkan organel-organel yang terdapat pada sel melalui sentrifugasi. Hasil yang diperoleh dari proses sentrifugasi tersebut harus dianalisis. Analisis komponen sel hati tikus dilakukan untuk mengetahui apakah komponen fraksi subseluler yang terkontaminasi satu dengan yang lainnya. Indikasi terjadinya pencemaran adalah adanya aktivitas spesifik suatu fraksi yang ditemukan dengan fraksi lainnya. Hal yang dilakukan adalah menentukan konsentrasi protein dari setiap fraksi subseluler sehingga dapat ditentukan aktivitas spesifik enzim yang ada pada fraksi subseluler. Protein memiliki peran penting dalam analisis komponen sel hati tikus.

Organ hati dari suatu organisme mengandung berbagai macam organel yang juga mengandung berbagai senyawa, protein misalnya. Protein yang terdapat dalam suatu organel tidak dapat dilihat dengan mata telanjang ataupun dengan mikroskop biasa, namun dapat diidentifikasi atau dianalisis dengan berbagai metode. Protein terbentuk dari asam amino. Ada dua jenis asam amino, yaitu asam amino esensial dan non esensial. Asam amino esensial adalah asam-asam amino yang tidak dapat disintesis oleh tubuh, hanya didapat dari luar tubuh (makanan),  sedangkan asam amino non esensial merupakan asam amino yang dapat disintesis oleh tubuh dari senyawa lain. Protein merupakan kelompok biomakromolekul yang sangat heterogen. Ketika berada di luar makhluk hidup atau sel, protein sangat tidak stabil. Untuk mempertahankan fungsi, setiap jenis protein membutuhkan kondisi tertentu jika diekstraksi dari normal biological milieu. Protein yang diekstraksi hendaknya dihindarkan dari proteolis atau dipertahankan aktivitas enzimatiknya. Untuk menganalisis protein yang ada di dalam sel tersebut, diperlukan prosedur fraksinasi sel yaitu memisahkan sel dari jaringannya, menghancurkan membran sel untuk mengambil kandungan sitoplasma dan organelnya serta memisahkan organel-organel dan molekul penyusunnya. Sebagian besar protein merupakan molekul yang mudah rusak bila tidak berada pada kondisi fisiologisnya. Karena itu, untuk mempertahankan struktur dan fungsi protein, fraksinasi dilakukan pada suhu rendah (0-4⁰C) dalam bufer dan pH tertentu (tergantung dari jenis protein yang dianalisis) (Anonim 2010).

Ada beberapa metode yang dapat digunakan untuk menentukan kadar protein suatu zat, yaitu metode Biuret, metode Lowry, metode Bradford, dan metode Smith copper. Percobaan ini menggunakan reagen biuret sebagai indikator absorbansi atau penyerapan cahaya oleh fraksi yang mengandung protein. Metode biuret ini merupakan metode yang sering digunakan untuk menentukan kadar protein suatu larutan, yaitu yang terjadi dengan semua senyawa yang mengandung dua atau lebih ikatan peptida dan metode Biuret sering digunakan karena bahan yang digunakan relatif murah. Akan tetapi, metode ini juga memiliki kelemahan, yaitu sensitivitas yang rendah terhadap bahan yang diidentifikasi. Dengan menentukan konsentrasi protein dari fraksi, dapat ditentukan aktifitas spesifik enzim. Aktivitas spesifik enzim pada fraksi yang diisolasi menggambarkan keefektifan prosedur yang telah dilakukan (Redin dan Campbell 1985). Sebagaimana percobaan sebelumnya, absorbansi larutan standar memiliki hubungan linear dengan konsentrasinya, yang kemudian dapat digunakan dalam penentuan kadar protein sampel.

Kadar protein yang terdapat pada fraksi yang telah diisolasi dapat ditentukan dengan mengukur panjang gelombang yang dapat diserap oleh fraksi tersebut. Panjang gelombang dipengaruhi oleh energi cahaya yang diberikan dan konsentrasi larutan tersebut. Semakin tinggi energi cahaya yang diberikan, semakin pendek panjang gelombang cahaya yang dibutuhkan untuk menembus larutan tersebut. Semakin tinggi konsentrasi suatu larutan, semakin besar panjang gelombang yang dibutuhkan untuk menembus larutan tersebut (Albert B et al 1994).

Spektofotometer ada dua jenis, yaitu spektofotometer Ultra Violet dan spektofotometer visible. Spektofotometer UV panjang gelombangnya antara 180-350 nm, sedangkan spektofotometer visible panjang gelombangnya antara 350-800 nm. Spektofotometer UV/vis menggunakan sinar tampak (Hart 2003). Pada praktikum ini digunakan spektofotometer UV/vis dengan panjang gelombang 540 nm.

Tujuan Percobaan

Praktikum ini bertujuan menentukan kadar protein pada fraksi homogenat,  inti, dan  mitokondria dengan menggunakan metode Biuret.

Alat dan Bahan

Alat-alat yang digunakan dalam praktikum ini antara lain, Spektrofotometer 20-D, pengaduk Vortex, tabung reaksi beserta rak, pipet mohr , bulp, penangas air, dan gelas piala.

Bahan-bahan yang digunakan dalam praktikum ini antara lain, reagen Biuret, fraksi homogenat hati tikus, fraksi inti, fraksi mitokondria, Albumin serum sapi (BSA) stok 2 mg/ml, sukrosa-EDTA 0.25 M-EDTA 1 mM, akuades, dan SDS (Sodium Dodesil Sulfat).

Prosedur Percobaan

Penentuan protein dilakukan dengan menyiapkan tiga set tabung reaksi. Pertama-tama disiapkan set tabung berjumlah enam buah tabung reaksi dan masing-masing tabung reaksi dimasukkan dengan homogenat 1 sebanyak 0.02 mL, homogenat 2 sebanyak 0.05 mL, fraksi inti 1 sebanyak 0.02 mL, Fraksi inti 2 sebanyak 0.05 mL, fraksi mitokondria 1 sebanyak 0.05 mL, dan fraksi mitokondria sebanyak 0.10 mL. Set tabung reaksi kedua sebagai blanko sukrosa yang masing-masing berisi 0.02 mL, 0.05 mL, dan 0.10 mL larutan sukrosa-EDTA 0.25 M-EDTA 1 mM.

Kedua set tabung reaksi tersebut ditambahkan akuades hingga volumenya menjadi 1.3 mL. Tabung reaksi yang berisi homogenat, fraksi inti, dan fraksi mitokondria kemudian dianalisis dengan menggunakan alat spektrofotometer pada panjang gelombang 540 nm dan dibaca nilai absorbannya. Pengukuran absorban suatu sampel biasanya dilakukan dengan mengukur absorbansi blanko terlebih dahulu agar dapat menjadi standar. Setelah itu baru dimasukkan sampel yang akan diukur absorbansinya. Set tabung ketiga berjumlah tujuh tabung reaksi yang berisi larutan standar albumin serum sapi (BSA) 2 mg/mL dan masing-masing tabung reaksi dimasukkan 0.1 mL, 0.2 mL, 0.4 mL, 0.6 mL, 0.8 mL. 1.0 mL, dan 1.2 mL. Selanjutnya ditambahkan akuades hingga volumenya menjadi 1.3 mL. Kemudian ditambahkan 0.2 mL larutan SDS dan 3 mL reagen Biuret. Setelah itu, diaduk menggunakan pengaduk Vortex hingga menjadi homogen dan dipanaskan dengan penangas air pada suhu 37⁰C selama 15 menit. Kemudian dibaca serapannya dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 540 nm.

Pembacaan  serapan pada set tabung ketiga akan menghasilkan sejumlah data absorban. Data tersebut kemudian digunakan untuk membuat kurva standar yang merupakan kurva hubungan absorban dengan konsentrasi . Dengan menggunakan persamaan garis linear, akan diperoleh persamaan y= a+bx dengan y sebagai absorban dan x adalah konsentrasi BSA. Kadar protein dalam setiap fraksi subseluler ditentukan dengan menggunakan persamaan garis tersebut.

Data dan Hasil Percobaan

Tabel 1 Data kurva standar

Konsentrasi (mg/mL)	Absorbansi sampel	Absorbansi blangko	Absorbansi terkoreksi
0.0000	0.0000	0.0000	0.0000
0.1538	0.0870	0.0710	0.0610
0.3077	0.0790	0.0710	0.0080
0.6154	0.1130	0.0710	0.0420
0.9231	0.1300	0.0710	0.0590
1.2308	0.1520	0.0710	0.0810
1.5385	0.1810	0.0710	0.1100
1.8462	0.1940	0.0710	0.1230

Contoh perhitungan:

[BSA] stok              = 2 mg/mL

Volume BSA          = 0.1 mL

Volume larutan = 1.3 mL

(V x M) _BSA = (V x M) _larutan

0.1 mL x 2 mg/mL = 1.3 mL x M _larutan

0.2 mg                     = 1.3 mL x M _larutan

M _larutan = 0.1538 mg/mL

Absorbansi terkoreksi = Absorbansi sampel – Absorban blanko

= 0.0870 – 0.0710

= 0.0610

Gambar 1 Hubungan konsentrasi BSA dengan Absorban

Tabel 2 Hasil analisis protein

Fraksi subseluler	Absorbansi fraksi	Absorbansi blangko	Absorbansi terkonsentrasi	Fpengenceran (mL)	Konsentrasi protein (mg/mL)
Homogenat 1	0.1560	0.0690	0.0870	65	84.1490
Homogenat 2	0.2820	0.0690	0.2130	26	81.2760
Fraksi inti 1	0.0680	0.0690	-0.0010	65	1.0140
Fraksi inti 2	0.0600	0.0690	-0.0090	26	-2.6182
Fraksi mitokondria 1	0.0830	0.0690	0.0140	26	6.0736
Fraksi mitokondria 2	0.0961	0.0731	0.0230	13	4.7372

Contoh perhitungan:

Fpengenceran =

=

= 65 mL

y = a+ bx

y = -2.0708.10^-3 + 0.0688 x

y = absorbansi terkoreksi

0.0870 = -2.0708.10^-3 + 0.0688 x

0.0891 = 0.0688 x

x          = 1.2946

konsentrasi protein = x  Fpengenceran

= 1.2946 65

= 84.1490 mg/mL

Pembahasan

Analisis komponen sel hati dengan metode Biuret diawali dengan pembuatan kurva standar  yang digunakan untuk menentukan konsentrasi protein yang terkandung dalam sel hati tikus. Kurva standar diperoleh dengan menghubungkan konsentrasi protein BSA dengan nilai absorbansinya (tabel 1 dan gambar 1). Hubungan kedua plot ini menunjukkan persamaan garis yang linier y= -2.0708.10^-3 + 0.0688 x dengan r= 0.9922. Persamaan garis ini yang digunakan untuk menentukan kadar protein yang terdapat dalam fraksi subseluler. Percobaan ini dapat dikatakan cukup berhasil karena nilai r yang diperoleh hampir mendekati satu.

Sampel yang dianalisis kandungan proteinnya dalam percobaan ini adalah fraksi subseluler yang diperoleh dari percobaan sebelumnya, yaitu fraksi homogenat, fraksi inti, dan fraksi mitokondria. Homogenat merupakan komponen sel hati tikus yang masih berupa bentuk sel yang hanya dihomogenasi dan belum diuraikan fraksi diperoleh dari sentrifugasi berlanjut terhadap pelet hasil sentrifugasi homogenat yang mengandung komponen inti sel. Sedangkan fraksi mitokondria adalah hasil sentrifugasi berlanjut terhadap supernatan hasil sentrifugasi homogenat. Komponen ini mengandung mitokondria sel. Fraksi-fraksi dijaga agar tidak rusak dan tetap aktif setelah diuraikan, sehingga aktifitas enzim masih dapat ditentukan untuk mengetahui kandungan proteinnya.

Hasil penentuan kadar protein dalam fraksi subseluler sel hati tikus menunjukkan adanya kandungan protein yang berbeda antar jenis fraksi subseluler (tabel 2). Kandungan protein tertinggi terdapat pada homogenat 1, yaitu 84.1490 mg/mL dan berikutnya homogenat 2 yaitu 81.2760 mg/mL. Hal ini dikarenakan homogenat merupakan larutan yang paling awal diperoleh dari proses fraksinasi menggunakan sentrifus sehingga pekat akan protein karena merupakan total organel-organel dalam hati. Sedangkan fraksi inti dan mitokondria tidak terlalu banyak mengandung protein karena fraksi tersebut mengalami beberapa kali proses fraksinasi. Semakin banyak proses sentrifugasi yang dilalui maka semakin besar kemungkinan rusaknya membran sel.

Untuk menentukan kadar protein tersebut, digunakan metode Biuret. Metode analisis yang digunakan dalam percobaan menekankan kesamaan reaksi dalam reagen yang digunakan terhadap ikatan peptida asam amino protein. Metode Biuret adalah suatu metode yang digunakan untuk menganalisis protein secara kuantitatif yang memanfaatkan reaksi biuret dengan mengidentifikasi ikatan peptida yang terdapat dalam suatu organel. Ikatan peptida adalah ikatan yang terjadi antara satu molekul asam amino dengan asam amino lainnya. Prinsip reaksi biuret adalah reaksi antara tembaga sulfat dalam alkali dengan senyawa yang berisi dua atau lebih ikatan peptida seperti protein yang memberikan warna ungu biru yang khas. Warna biru yang dihasilakan menunjukkan reaksi positif adanya protein. Reaksi ini masih bersifat kualitatif. Fungsi reagen biuret adalah untuk membentuk kompleks sehingga yang dikandung dapat diidentifikasi. Reaksi Biuret ini bersifat spesifik, artinya hanya senyawa-senyawa yang mengandung ikatan peptida saja yang akan bereaksi dengan pereaksi Biuret (Albert et al 1994).

Reagen biuret dibuat dari kalium hidroksida (KOH) dan tembaga (II) sulfat (CuSO₄ bersama dengan kalium natrium tartrat). Warna dalam reaksi reagen akan berubah menjadi violet dengan kehadiran dari protein dan berubah menjadi pihak ketika dikombinasikan dengan rantai pendek polipeptida, sehingga warna akhir yang ditunjukkan adalah biru keunguan. Natrium hidroksida tidak terlihat pada reaksi secara keseluruhan tetapi hanya ada untuk menyediakan medium alkali sehingga reaksi dapat berlangsung. Reagen ini biasa digunakan pada uji Biuret, sebuah uji kolorimetri untuk menetukan konsentrasi protein. Struktur kimia reagen Biuret adalah RHN-CO-NR-CO-NHR (Hart 2003).

Analisis kualitatif dilakukan dengan metode serapan sinar tampak spektrofotometer pada panjang gelombang 540 nm. Panjang gelombang ini memberikan uji yang sensitif dan merespon maksimum pada unit protein. Tartrat ditambahkan pada reagen ini untuk menambah shelf life reagen ini (Albert et al 1994).

Larutan sukrosa-EDTA 0.25 M-EDTA 1 mM dipilih sebagai blanko karena larutan ini merupakan bufer yang cocok untuk BSA. Pembuatn kurva standar BSA bertujuan mengukur absorbansi larutan standar yang telah diketahui konsentrasinya, mem-plot absorbansi larutan standar, sehingga memperoleh nilai sampel yang tidak diketahui dengan menggunakan grafik (Seidman dan Mowery 2008). Blanko dapat diartikan komponen yang mendapat perlakuan sama dengan sampel tanpa mengandung komponen analat. Jadi, blanko yang dipakai harus sesuai dengan pelarut pada masing-masing sampel. Namun pada fraksi inti ketika percobaan fraksi subseluler diberi sukrosa-CaCl₂ dan pada percobaan analisis komponen sel hati tikus menggunakan sukrosa-EDTA 0.25 M-EDTA 1 mM. Sehingga dapat dikatakan terjadinya kesalahan blanko yang digunakan yang mengakibatkan nilai minus pada fraksi inti, yaitu fraksi inti 1 sebesar  -0.0010 dan fraksi inti 2 sebesar  -0.0090

Penentuan kadar protein dilakukan berdasarkan kurva standar dari larutan BSA (Bovine Serum Albumin). BSA adalah protein yang relatif kecil yang ditemukan pada plasma darh mamlia dan serum. Senyawa ini merupakan pembawa protein yang membantu distribusi kation dan materi tak-larut seperti hormon steroid dan asam lemak pada darah. Protein BSA ini mudah didapat, harganya relati murah, dan tidak memiliki aktivitas enzim khusus yang menginterferensi reaksi. Protein ini biasanya dipakai untuk kebutuhan preparasi protein pada umumnya. Pada pembuatan standar, campuran BSA dan akuades ditambahkan larutan SDS, akuades berfungsi sebagai pengencer sedangkan SDS berfungsi memecah ikatan-ikatan hidrofobik pada protein (yang menggulung) sehingga reagen biuret dapat bereaksi secara sempurna dengan protein atau mendenaturasi protein yang terdapat pada larutan fraksi subseluler. Serelah itu dimasukkan dalam penangas air yang bersuhu 37⁰C, suhu tersebut adalah suhu kamar (suhu optimum). Tujuannya suhu 37⁰C adalah membuat aktivitas enzim sangat efektif. Aktivitas enzim sangat dipengaruhi oleh suhu, pada suhu rendah aktivitas enzim inaktif sedangkan pada suhu tinggi protein terdenaturasi (Seidman dan Mowery 2008).

Simpulan

Diperoleh persamaan garis y= -2.0708.10^-3 + 0.0688 x dengan r= 0.9922. Persamaan garis ini yang digunakan untuk menentukan kadar protein yang terdapat dalam fraksi subseluler. Percobaan ini dapat dikatakan cukup berhasil karena nilai r yang diperoleh hampir mendekati satu. Kandungan protein tertinggi terdapat pada homogenat 1, yaitu 84.1490 mg/mL dan berikutnya homogenat 2 yaitu 81.2760 mg/mL. Hal ini dikarenakan homogenat merupakan larutan yang paling awal diperoleh dari proses fraksinasi menggunakan sentrifus sehingga pekat akan protein karena merupakan total organel-organel dalam hati. Sedangkan fraksi inti dan mitokondria tidak terlalu banyak mengandung protein, yaitu fraksi inti 1 1.0140, fraksi inti 2 -2.6182, mitokondria 1 6.0736, dan mitokondrai 2 4.7372 karena fraksi tersebut mengalami beberapa kali proses fraksinasi. Semakin banyak proses sentrifugasi yang dilalui maka semakin besar kemungkinan rusaknya membran sel.

Daftar Pustaka

Albert B et al. 1994. Biologi Molecular Sel. Ed ke- 2. Jakarta: Gramedia Pustaka Utama

[Anonim]. 2010. Sumber gizi protein [terhubung berkala]. http://www.hsph. harvard. edu/nutritionsource/what-should-you-eat/protein/ [13 mei 2010]

Hart H. 2003. Kimia Organik.: Suatu Kuliah Singkat. Ed ke-11. Penerjemah; Achmadi SS, editor; Safitri A. Jakarta: Erlangga. Terjemahan dari: Organic Chemistry.

Redin B dan Campbell WH. 1985. Adaptation of the Dye-bind-ing Protein Assay to Microtiter Plates. Analytical Biochemistry. [terhubung berkala]. http://translate.google.co.id/translate?hl=id&sl=en&u=http://www.d.umn.edu/~pkiprof/chem3324/ProteinAssayProtocol.pdf [13 Mei 2010]

Seidman L dan Mowery J. 2008. The Bradford Microassay [terhubung berkala]. http://matemadison.edu/biotech/resources/protein/labManual/chapter_3/procedure3_1.htm [13 Mei 2010]

ANALISIS KUALITATIF TERBATAS: GOLONGAN

KLORIDA DAN SPOT TEST

Prinsip Percobaan

Pada dasarnya, ada pemeriksaan pendahuluan yang menghasilkan kesimpulan sementara untuk analisa selanjutnya. Ada 2 macam reaksi yang penting untuk analisa yaitu reaksi spesifik (reaksi khas atau reaksi spesifik untuk bahan tertentu) dan reaksi sensitif (mampu menunjukan bahan yang hanya ada sedikit sekali). Dapat disebut pula reaksi selektif, ialah reaksi yang terjadi atas sekelompok bahan yang berbeda-beda, misalnya bila ion Cl^- ditambahkan kepada kation, maka dapat terjadi endapan. Reaksi ini tidak spesifik, sebab yang dapat mengendap dengan Cl^- itu tidak hanya satu macam kation, tetapi 3 macam, yaitu Ag⁺, Pb²⁺, Hg⁺. Reaksi ini penting untuk dianalisa, sebab misalnya bila reaksi di atas tidak terjadi, maka dapat disimpulkan, bahwa Ag⁺, Pb²⁺, dan Hg⁺ tidak terdapat dalam bahan yang dianalisa (Harjadi 1990).

Analisis kualitatif digunakan untuk mengidentifikasi macam atau jenis bahan dan komponen-komponen bahan yang terdapat dari suatu sampel (Day & Underwood 1996). Kita akan fokuskan pada kation. Dua puluh kation yang lazim dapat dianalisis dengan mudah dalam larutan berair. Kation-kation ini dapat dibagi ke dalam 5 golongan berdasarkan hasil kali kelarutan garam tak larutnya. Karena larutan tak diketahui mungkin mengandung lebih dari satu ion tersebut, analisis harus dilakukan secara sistematis dari golongan 1 sampai golongan 5 (Chang 2005). Sedangkan spot test pada senyawa organik dan anorganik dapat digunakan untuk menentukan bahan individu tertentu dan susunan dalam suatu campuran. Spot test ini memeriksa ion-ion dalam suatu campuran yang akan member efek yang khas terhadap zat tertentu yang dicampur dengan ion tersebut (Schenk 1981).  Reaksi spot test yang spesifik akan memberi efek yang khas terhadap zat tertentu atau pada contoh yang jumlahnya sangat sedikit.

Tujuan Pecobaan

Menguji keberadaan ion pada larutan ion 1, ion 2 dan ion3 menggunakan metode H₂S dan menganalisis ion pada suatu bahan dengan metode spot test menggunakan pereaksi selektif dan spesifik.

Alat dan Bahan

Alat-alat yang digunakan pada praktikum ini adalah sentrifusa, tabung reaksi, gelas piala 250 mL, pembakar gas, Tabung sentrifusa, gegep, kaki tiga, dan spot plate. Bahan-bahan yang digunakan adalah ion Ag⁺, Pb²⁺, Hg₂²⁺, Co^2+, Fe^3+, Mn^2+, Ni^2+, I^-, MoO₄^2-, WO₄^2-, SCN^-, Fe(CN)₆^4-, aqua regia, HCl 1 N, HNO₃, H₂SO^4-,  K2CrO4 5%, KI 1 N, NH₄OH 4 N, (NH₄)₂S 1 M, dan pereaksi untuk spot test.

Prosedur Percobaan

Sama dengan prosedur yang ada pada buku penuntun praktikum, tetapi ada tambahan pada metode H₂S maupun spot test senyawa ANU yang digunakan ada tiga buah (ion 1, ion 2, ion 3).

Pembahasan

Pencarian logam-logam yang mungkin ada dalam suatu larutan dapat menggunakan analisis kualitataif terbatas atau dengan menggunakan spot test. Dalam analisis kualitatif ini digunakan bantuan reaksi-reaksi kimia, yaitu: reaksi spesifik, reaksi sensitif, dan reaksi selektif. Reaksi spesifik adalah reaksi yang terjadi antara bahan satu dengan bahan yang lain atau dengan energinya yang bersifat khas untuk bahan tertentu. Reaksi sensitif adalah reaksi yang terjadi untuk menunjukkan bahan yang dianalisis dalam jumlah yang sedikit sekali hasilnya sudah jelas (reaksi peka). Reaksi selektif adalah reaksi yang terjadi ats sekelompok bahan dan dapat membedakan kelompok satu dengan kelompok lain (Harjadi 1987).

Percobaan kali ini analisis kualitatif terbatas dengan metode H₂S digunakan untuk menguji golongan klorida. Golongan klorida terdiri atas kation Ag⁺, Pb⁺, dan Hg₂²⁺. Larutan Anu yang digunakan untuk memeriksa keberadaan kation-kation tersebut di campur dengan larutan HCl sehingga membentuk endapan putih untuk logam Pb²⁺, Ag⁺_, dan Hg₂²⁺_, yang kemudian direaksikan dengan larutan pengendap untuk membuktikan keberadaan ion logamnya.

Percomaan spot test dilakukan pengujian terdapat sembilan macam ion logam (Co^2+, Fe^3+, Mn^2+, Ni^2+, I^-, MoO₄^2-, WO₄^2-, SCN^-, Fe(CN)₆^4-). Spot test ini menghasilkan reaksi spesifik yaitu reaksi yang memberi efek yang khas terhadap zat tertentu atau pada contoh yang jumlahnya sangat sedikit. Percobaan spot test ini hampir semua reaksi positif, tetapi ada yang tidak sesuai dengan hasil yang diinginka, yaitu MoO₄^2- dan WO₄^2-. Hasil yang didapat dari reaksi MoO₄^2- dengan pereaksi yang digunakan berwarna kuning, seharusnya berwarna merah, WO₄^2- menghasilkan warna kuning seharusnya warna hijau kebiru-biruan. Dari data tersbut dapat dibuktikan bahwa MoO₄^2- dan WO₄^2- tidak ada.

Begitu pula dengan larutan Anu (ion 1 dan ion 2) pada metode H₂S, yang direaksikan dengan pereaksi yang sesuai tidak menghasilkan endapan. Pada ion 1 tidak ada endapan jingga berarti ion 1 tidak mengandung Pb²⁺ dan pada ion 2 tidak mengandung Hg₂²⁺ karena tidak terdapat endapan kelabu.

Pereaksi- pereaksi yang digunakan pada percobaan ini berfungsi untuk membuktikan keberadaan golongan klorida (Pb²⁺, Ag⁺_, dan Hg₂²⁺) dengan metode H₂S dan ion-ion yang diperiksa dengan spot test.

Kesalahan-kesalahan pada percobaan ini mungkin dapat terjadi. Karena data bersifat kualitatif dan dilakukan tanpa pengulangan, adanya kesalahan-kesalahan sulit diketahui. Kesalahan yang terjadi pada percobaan ini mungkin disebabkan oleh adanya kontaminan pada larutan yang akan diuji, pada reagen, atau pada media yang digunakan. Kontaminan ini dapat memunculkan atau meniadakan ion yang seharusnya ada atau tidak ada pada larutan yang akan diuji.

KROMATOGRAFI

Prinsip Percobaan

Kromatografi adalah suatu metode pemisahan fisik, di mana komponen-komponen yang dipisahkan didistribusikan di antara dua fasa, salah satu fasa tersebut adalah suatu lapisan stasioner dengan permukaan yang luas, yang lainnya sebagai fluida yang mengalir lembut di sepanjang landasan stasioner. Fasa stasioner bisa serupa padatan maupun cairan, sedangkan fasa bergerak bisa berupa cairan maupun gas. Dalam semua teknik kromatografi, zat-zat terlarut yang dipisahkan bermigrasi sepanjang kolom (seperti dalam kromatografi kertas atau lapis tipis, ekivalen fisik kolom), dan tentu saja dasar pemisahan terletak dalam laju perpindahan yang berbeda ( Day 2002).

Metode kromatografi adalah teknik yang efektif dan dapat digunakan untuk memisahkan komponen yang sulit dipisahkan dengan metode lain. Berdasarkan proses terjadi, kromatografi dibedakan menjdi kromatografi partisi, ditemukan dalam kromatografi kertas dan kromatografi lapis tipis, kromatografi adsorpsi, ditemukan dalam kromatografi kolom, kromatografi pertukaran ion  dan kromatografi eklusi (Anonim 2010) .

Beberapa zat yang diteteskan pada kertas dapat bergerak pindah lebih cepat daripada yang lain. Kelarutan suatu partikel terhadap pelarutnya mempengaruhi kecepatan perpindahan tersebut. Semakin mudah suatu partikel larut, semakin cepat pula laju geraknya. Suatu campuran pewarna dapat dipisahkan dengan teknik kromatografi karena adanya perbedaan kelarutan antara zat penyusun campuranpewarna tersebut. Selain itu, kecepatan bergerak partikel penyusun sangat dipengaruhi oleh ukuran partikel penyusunnya. Partikel penyusun yang lebih akan bergerak lebih cepat daripada partikel penyusun yang berukuran lebih besar (Kamilati 2006).

Pengukuran uji kromatografi dapat dilakukan secara kualitatif dan kuantitatif. Secara kuantitatif, perbandingan jarak yang ditempuh oleh suatu warna dengan jarak pelarut disebut dengan Rf. Variasi jumlah Rf menunjukkan banyaknya komponen penyusun campuran yang sedang kita pisahkan dengan metode kromatografi ini. Berbagai nilai Rf ini kita bandingkan satu sama lain. Nilai Rf yang terbesar dimiliki oleh komponen penyusun yang memiliki ukuran partikel terkecil dan sebaliknya nilai Rf yang terkecil adalah yang memiliki ukeran partikel penyusun terbesar (Kamilati 2006).

Tujuan Percobaan

Praktikum kali ini bertujuan menununjukkan sifat khas dari suatu indikator dalam campuran dan pemisahan susunan logam pada uang logam.

Prosedur Percobaan

Prosedur percobaan sama dengan prosedur yang ada pada buku penuntun praktikum, tetapi yang dilakukan hanya percobaan pemisahan campuran indikator dan pemisahan susunan logam pada uang logam.

Pembahasan

Metode kromatografi melibatkan dua fase yaitu fase diam dan fase gerak. Fase diam sangat penting dalam pemisahan fisik dengan unsur-unsur yang akan didistribusi. Fase ini membentuk lapisan stasioner dengan permukaan yang besar sehingga dapat melalui lapisan stsioner . Eluen berperan terhadap aktivitas adsorbent, daya tarik menarik antara fraksi zat dengan adsorbent tergantung dari daya elektrostatis (Hargoss 1998).

Percobaan kali ini digunakan kromatografi partisi, yaitu kromatografi kertas. Prinsip kromatografi partisi dapat dijelaskan dengan hukum partisi yang dapat diterapkan pada sistem multikomponen. Dalam kromatografi partisi, ekstraksi terjadi berulang dalam satu kali proses. Dalam percobaan, zat terlarut didistribusikan antara fasa stationer dan fasa mobil. Fasa stationer dalam banyak kasus pelarut diadsorbsi pada adsorben dan fasa mobil adalah molekul pelarut yang mengisi ruang antar partikel yang ter adsorbsi. Sampel yang akan dianalisis ditotolkan ke ujung kertas yang kemudian dimasukkan dalam botol kromatografi.. Kemudian dasar kertas kromatografi Whatman dicelupkan kedalam pelarut yang mengisi dasar wadah. Fasa mobil (pelarut) dapat saja beragam. Pelarut pada percobaan ini adalah n-butanol, asam asetat glasial, dan air (Anonim 2010).

Saat komponen menaiki lembaran kertas secara vertikal karena ada fenomena kapiler, partisi komponen antara fasa mobil dan fasa diam (air) yang teradsorbsi pada selulosa berlangsung berulang-ulang. Pelarut mencapai ujung atas kertas proses dihentikan. Setiap komponen bergerak dari titik awal sepanjang jarak tertentu (Anonim 2010).

Pemisahan susunan logam pada uang logam kuning menggunakan ion Ni²⁺, Cu²⁺, Co²⁺, Al³⁺, Ag²⁺, dan Pb²⁺ dengan pelarut aseton, HCl pekat, dan air. Ion-ion diteteskan di garis start sebanyak sepuluh kali di atas kertas kromatografi. Kemudian kertas dimasukkan ke dalam botol yang berisi campuran pelarut n-butanol, asam asetat glasial, dan air dengan start di bagian bawah. Setelah pelarut bergerak dari bawah ke atas kemudian kertas diangkat. Jarak batas eluen dari tempat penetesan adalah 10.2 cm. Sedangkan jarak komponen sampel 1.8 cm, Ni²⁺ 0 cm , Cu²⁺ 0.8 cm, Co²⁺ 3.3 cm, Al³⁺ 0 cm, Ag²⁺ 2.9 cm, dan Pb²⁺ 2.1 cm. Nilai Rf ditentukan dengan membandingkan jarak komponen dengan jarak eluen. Rf  sampel 0.1765 cm, Ni²⁺ 0 cm , Cu²⁺ 0.0784 cm, Co²⁺ 0.3235 cm, Al³⁺ 0 cm, Ag²⁺ 0.2843 cm, dan Pb²⁺ 0.2059 cm. Spot Sampel memiliki spot berwarna hijau kebiruan, spot Ni²⁺ memiliki spot yang tidak bergerak, spot Cu²⁺ memiliki spot berwarna hijau kebiruan, Co²⁺ memiliki spot berwarna merah muda, Al³⁺ memiliki spot yang tidak bergerak , Ag²⁺ memiliki spot berwarna coklat, dan Pb²⁺ memiliki spot berwarna kuning.

Pemisahan susunan logam pada uang logam putih menggunakan ion sampel, Ag⁺, As³⁺, Pb²⁺, Ni²⁺, Co²⁺, dan Cu²⁺ dengan pelarut aseton, HCl pekat, dan air. Ion-ion diteteskan di garis start sebanyak delapan kali di atas kertas kromatografi. Kemudian kertas dimasukkan ke dalam botol yang berisi campuran pelarut n-butanol, asam asetat glasial, dan air dengan start di bagian bawah. Setelah pelarut bergerak dari bawah ke atas kemudian kertas diangkat. Jarak batas eluen dari tempat penetesan adalah 8.8 cm. Sedangkan jarak komponen sampel 0 cm, Ag⁺ 3.3 cm, As³⁺ 0 cm, Pb²⁺ 2.9 cm, Ni²⁺ 0 cm, Co²⁺ 3.8 cm, dan Cu²⁺ 0 cm . Nilai Rf ditentukan dengan membandingkan jarak komponen dengan jarak eluen. Rf sampel 0 cm, Ag⁺ 0.3750 cm, As³⁺ 0 cm, Pb²⁺ 0.3295 cm, Ni²⁺ 0 cm, Co²⁺ 0.4318 cm, dan Cu²⁺ 0 cm. Spot Sampel memiliki spot warna yang tidak bergerak, spot Ag⁺ memiliki spot warna yang tidak bergerak, spot As³⁺ memiliki spot warna yang tidak bergerak, Pb²⁺ memiliki spot berwarna kuning, Ni²⁺ memiliki spot warna yang tidak bergerak, Co²⁺ memiliki spot berwarna merah muda, dan Cu²⁺ memiliki spot warna yang tidak bergerak.

Pemisahan campuran indikator menggunakan indikator congo red, bromfenol biru, fenol red, dan campuran dengan pelarut aseton, HCl pekat, dan air. Indikator diteteskan di garis start sebanyak tujuh kali di atas kertas kromatografi. Kemudian kertas dimasukkan ke dalam botol yang berisi campuran pelarut n-butanol, asam asetat glasial, dan air dengan start di bagian bawah. Setelah pelarut bergerak dari bawah ke atas kemudian kertas diangkat. Jarak batas eluen dari tempat penetesan adalah 12.8 cm. Sedangkan jarak komponen indikator congo red 8.1 cm dengan warna merah muda, bromfenol biru 12.8 cm dengan warna hijau kekuningan, fenol red 9.9 cm dengan warna kuning, dan campuran indikator mengandung tiga warna dari indikator tersebut, yaitu warna yang mengandung dari indikator congo red dengan warna merah muda dan jarak 6.4 cm, bromfenol biru dengan warna hijau kekuningan dan jarak 12.8 cm, dan fenol red dengan warna kuning dan jarak 9.2 cm. Nilai Rf ditentukan dengan membandingkan jarak komponen dengan jarak eluen.  Rf indikator congo red adalah 0.6328 cm, bromfenol biru adalah 1.0000 cm, fenol red adalah 0.7734 cm, campuran indikator yang mengandung warna hijau kekuningan dari indikator bromfenol biru adalah 1.0000 cm, dari indikator congo red yang mengandung warna merah muda adalah 0.5, dan dari indikator fenol red yang mengandung warna kuning adalah 0.7188 cm.

Hasil percobaan dari pemisahan susunan logam pada uang logam kuning menunjukkan warna pada sampel adalah hijau kebiruan dan pada kertas kromatografi yang menunjukkan warna hijau kebiruan adalah logam cuprum. Dapat dikatakan bahwa sampel mengandung logam cuprum. Percobaan dari pemisahan logam pada uang logam putih menunjukkan bahwa sampel tidak mengalami pergerakan dari start menuju front namun ion Ag⁺, Pb²⁺, dan Co²⁺ bergerak sehingga sampel tidak mengandung logam tersebut.

Sehingga Eluen yang dibuat dapat dikatakan tidak baik untuk memisahkan logam yang tidak berada dalam sampel tersebut. Indikator campuran mengandung warna dari indikator congo red, bromfenol biru , dan fenol red dapat dikatakan bahwa eluen tersebut baik dalam memisahkan indikator campuran. Pemilihan eluen dalam kromatografi harus benar-benar polar cenderung menyaingi permukaan sehingga mudah menggerakan solut melalui sistem berdasarkan deret elutropi. Pelarut tersebut dipilih berdasarkan sifat kepolaran. Pada deret eluotropi, efek elusi naik dengan kepolaran pelarut.

Simpulan

Eluen yang dibuat dapat dikatakan tidak baik untuk memisahkan logam yang tidak berada dalam sampel tersebut. Indikator campuran mengandung warna dari indikator congo red, bromfenol biru , dan fenol red dapat dikatakan bahwa eluen tersebut baik dalam memisahkan indikator campuran. Nilai Rf dan warna spot spesifik untuk setiap senyawa sehingga nilai Rf dapat digunakan sebagai variabel identifikasi untuk analisis kualitatif dalam kromatografi.